《Journal of Biophotonics》|基于无标记荧光寿命成像技术分选年轻的酿酒酵母单细胞

2022.02.18

2022年1月3日，复旦大学马炯教授团队应用辰英核心产品——PRECI SCS单细胞分选仪在《Journal of Biophotonics》杂志上发表了题为“Single Cell Sorting of Young Yeast Based onLabel-free Fluorescence Lifetime Imaging Microscop”的论文，基于无标记荧光寿命成像结合单细胞分选技术在单细胞水平上分选年轻有活力的酵母细胞，在发酵工业具有较大的应用价值。

一、研究背景

酵母在工业发酵过程中被重复利用，但是酵母生长过程中存在明显的异质性。在发酵过程中，高活性的酵母细胞在随后的发酵过程中至关重要。随着细胞的衰老，代谢活动的减少是影响酵母功能的重要因素。因此,一个精准区分衰老酿酒酵母和年轻酵母的方法是必要的。为了研究年轻酵母的识别分选方法，作者使用荧光寿命成像（FLIM）和激光诱导正向转移(LIFT)技术，在细胞原位状态下，通过无标记的荧光寿命成像技术高精度识别、激光诱导正向转移技术分选年轻的酵母细胞。本研究发现NAD(P)H可以作为FLIM检测的生物标志物，用于准确区分酵母细胞的代谢状态，进而判断酵母年轻或衰老。这种无标记荧光成像原位分选方法为酿酒酵母在工业和研究中的许多应用提供了一个新的途径。

摘要图

二、研究成果

1. 酿酒酵母的生长曲线和芽痕：研究中发现不同酵母细胞表面同时存在不同数量的芽痕。少于两个芽痕的酵母细胞数基本保持不变，这与之前的报告结果一致。在酵母生长曲线研究中，图2A所示的结果表明酵母生长20小时，然后酵母生长达到对数期，酵母数量基本保持不变。酵母芽痕染色如图2B所示，酵母细胞的芽痕从0到6个不等，表明酵母在同一时间点有很强的异质性。在不同的培养时间，每个时间点至少计数600个酵母细胞的芽痕。如图2C所示，酵母细胞出芽率由6 h的9.3%±1.4%逐渐下降至48小时的0.4%±0.4%。在基本条件保持不变连续培养的情况下，少于两个芽痕的酵母细胞数约占总酵母细胞的65%-70%。此外，还发现有2 ~ 4个芽痕的酵母细胞在6 ~ 36 h无显著性差异(15%~20%)，但是在48h微降至 13.4% ± 1.4%。有4个以上芽痕的酵母从6 h 的5.0% ±1.2% 到12 h 的8.3% ± 1.7%, 在连续培养下，24h达到了13.2% ± 1.0%，36 h 17.4% ± 5.0%。36h (17.4%±5.0%)和48h的(15.1%±1.1%)无显著差异。结果表明，将酵母细胞在一个培养基中培养时，酵母的年龄分布有明显的异质性。

图2 酵母的生长曲线及不同生长时间的含有不同芽痕数目的酵母比例

2.酵母细胞NAD(P)H的荧光成像：通过NAD(P)H荧光寿命研究酵母细胞的代谢状态的手段包括平均寿命 (tm)，结合蛋白的NAD(P)H的占比 (a2)，游离的NAD(P)H的寿命(t1)，以及结合蛋白的NAD(P)H 的寿命(t2)。酵母6h至 48h tm 和a2 的荧光寿命图像如图3A所示。绿色代表酵母细胞的 tm在0.2–0.6ns，红色代表tm在0.6–1.5ns。局部放大的图像中显示的是在12h一个典型的正在出芽的细胞，母细胞的tm和 a2分别为0.51ns和21.38%，而子细胞的tm和a2较小，分别为0.32 ns 和16.72%。tm和a2的分布曲线如图3B所示，每个曲线由150-200个酵母细胞的加和得出。tm的峰值从6h的0.36ns 增加到48h的0.58ns。a2 的峰值从6h的10.40%增加到48h的21.98%。图3C中显示的统计数据分析并平均了每个时间点的150到200个酵母细胞。发现酵母在6h的tm为 0.36±0.09ns，这与48h的0.58 ±0.11ns 显著不同，但与12h的0.37 ±0.03ns，24h的0.36±0.05ns，36h的0.51±0.10ns 没有明显差异。此外，6h的a2为10.40%±0.58%，与24h的16.40% ±1.34%，36h的 18.80%±1.63%，尤其是48 h的21.98%±2.56%有显著差异，与12h的11.15% ±0.50%无显著性差异。此外，tm由三个独立的参数，t1，t2 和a2决定的。基于我们的FLIM数据（图3和图S1），选择a2作为区分年轻细胞的独立参数，因为老化酵母的a2大于年轻的酵母。同时，从 6 到36ht1和t2无显著差异。酵母24h的a2平均值为16.40%，24h的酵母细胞处于对数生长状态。因此，将16%的a2值作为区分酵母细胞是否年轻的标准。

图3 酵母6 h – 48 h荧光寿命成像及统计分析结果

3. 酵母单细胞分选：通过 LIFT 系统分选年轻的酵母细胞，随后在培养箱中培养。分选流程图和分选芯片示意图如图4A和4B所示。图4C 显示了三个原位酵母细胞分选前后的FLIM显微图像。如图4C所示，一个a2较大的酵母细胞（红色箭头，18.3%）和具有较小 a2的2个酵母细胞（绿色箭头，13.4% 和 14.8%）可以通过 FLIM 区分识别。然后，利用LIFT系统分别将三个酵母细胞分选到单独的培养皿中。2个a2较小的酵母细胞在培养24h后形成单克隆菌落（图4D），而a2（18.3%）较大的酵母未形成单克隆菌落。对照组结果显示，95%的酵母细胞分选后存活并形成单克隆菌落。

然而，结合蛋白的NAD(P)H（a2）值小于16%的酵母细胞，即年轻活跃的细胞，分选结果显示有84± 3% 的细胞可以形成一个菌落（图 4E）。进而可以推测，由FLIM的激发激光带来的损伤约占11%。将来如果荧光信号变得更高或荧光检测系统更加敏感，光损伤可以进一步减少。

图4 分选原理及分选芯片示意图及荧光寿命结合

三、结论

本研究展示了一种在单细胞水平上，基于细胞代谢和使用 FLIM 和 LIFT结合的方法分选年轻酵母细胞的分选系统。酵母老化过程中的代谢变化，包括结合蛋白的NAD(P)H占比数值 (a2) 和 NAD(P)H平均荧光寿命 (tm)的增加。因此，将NAD(P)H作为FLIM检测的生物标志物，可用于准确区分年轻和老化的酵母细胞。当酵母细胞保持在无菌和潮湿的环境中，通过低分选能量的LIFT 系统，可将年轻的高活性酵母细胞一一分选到培养基中并重新培养至形成独立的单克隆菌落。作为一种广泛使用的工业模型和疾病研究的微生物，酿酒酵母在市场和研究中具有较强的吸引力。这种无标记原位分选方法为酿酒酵母在工业和研究中的许多应用提供了一个新的方法，在发酵工业具有重要应用价值。

文献链接：

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34978383/

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