《Environmental Microbiology》 | HOOKE单细胞分选仪助力肠道耐药菌表型与基因型的关联研究
3月1日，辰英科仪与牛津大学Wei E. Huang教授团队应用辰英核心产品——单细胞分选仪HOOKE PRECI SCS，在肠道耐药菌研究中取得突破性进展，成果以“Raman-activated sorting of antibiotic-resistant bacteria in human gut microbiota”为题目发表在微生物领域知名学术期刊《Environmental Microbiology》。该研究成果首次在单细胞水平上揭示了肠道中的耐药菌及耐药基因组成与个人用药史有关。
原文链接：https://sfamjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/1462-2920.14962 。
Q1
研究背景
肠道菌群中的耐药菌（antibiotic-resistant bacteria，ARB）及耐药基因（antibiotic-resistant genes，ARG）与人体健康和疾病息息相关。抗生素的使用对肠道菌群的多样性、结构与功能具有巨大而持久的影响，可导致耐药菌的产生与流行，进而增加肥胖，糖尿病，炎症性肠病等多种疾病的风险。人体肠道菌群中ARB的分析和鉴定，对临床实践和精准医学具有重要意义。
目前肠道菌群研究的主要方法为培养与宏基因组测序。但由于大部分微生物尚不可培养，且人工培养难以还原微生物在环境中的真实状态，因此需要不依赖于培养的原位研究方法。高通量宏基因组测序技术实现了对肠道微生物群落多样性和功能基因的探索。然而，该方法基于细胞群体水平，可能会丢失细胞异质性信息，无法提供群落中哪个特定成员发挥重要作用，尤其是当ARB在菌群中以少数群体形式存在时。完全破译特定微生物在复杂群落（如肠道菌群）中的作用，并将其功能表型与基因组联系起来仍然非常困难。
本研究应用氘标记拉曼光谱（Raman microscopy combined with deuterium isotope probing, Raman–DIP）结合单细胞分选系统（Raman-activated cell sorting，RACS），对健康志愿者的肠道微生物菌群进行了研究。在单细胞层面揭示了菌群中不同耐药菌的组成和丰度与个体用药史具有很高的相关性。
Q2
实验设计
在这项研究中，首先应用Raman-DIP技术对在不同浓度抗生素（包括阿莫西林、头孢氨苄、四环素、氟苯尼考、万古霉素）作用下，健康成人肠道微生物中的ARB进行识别。之后使用单细胞分选仪PRECI SCS将ARB从菌群中分选出来，经过单细胞全基因组扩增、测序和分析，确定志愿者的ARB种类和功能序列，从而建立ARB表型与基因型之间的联系（如图1）。
图1. 实验设计思路
Q3
结果与讨论
1. Raman-DIP原位鉴定肠道耐药菌
在微生物培养时加入抗生素及重水（D2O），具有代谢活性的耐药菌会吸收重水，在拉曼静默区出现C-D 峰（1800-2700 cm-1），而抗生素敏感的个体则不会出现此峰（Fig.1A）。根据拉曼检测得到C-D结果，实现了对形态和大小没有明显差别的CephR 以及CephS群体的区分（Fig.1B）。添加抗生素不会影响被氘标记微生物群体的占比（Fig.1C）。
图2. (A)人肠道微生物经抗生素与重水原位培养后的单细胞拉曼光谱(SCRS)，标记位置为C-D峰(2070-2300 cm-1) (R:耐药株;S:感性品系)；(B) 头孢氨苄（2×MIC浓度）与重水培养的肠道菌显微图像，红色方框内为具有C-D峰的菌；(C) A中各个菌的C-D峰相对强度的统计结果。
2. 人体肠道ARB丰度与个体用药史相关
本研究分析来自两个志愿者肠道样品在不同抗生素下的ARB比例分布，不同抗生素间、不同个体间有很大的差异（Fig.2）。
菌群的耐药比例分布与国内抗生素使用情况相关。其中抗阿莫西林（Amox）以及头孢氨苄（Ceph）菌群的高占比可归因于国内对这两种抗生素的滥用。而万古霉素（Van）由于仅用于耐药后的紧急治疗，因此该类ARB占比几乎为零。说明人体肠道ARB丰度与抗生素暴露史有关系。
图3. 两名志愿者肠道微生物的耐药性分布。
3. 单细胞分选实现耐药菌表型与基因型的关联
在这项研究中，我们应用单细胞分选仪PRECISCS，分别对两名志愿者的肠道菌群中的AmoxR，CephR和CephS表型微生物进行单细胞分离，对分离出的目标单细胞进行全基因扩增和测序。
图5展示了来自两个分类样本的总共28个ARG亚型，分为12种ARG类型。这些编码抗性亚型的丰度范围为0到3.5。值得一提的是，尽管万古霉素抗性基因（vanG，vanH，vanR和vanU）的丰度很高，但我们并未在CephR样品中检测到VanR菌的存在（图5），这可能是由于抗性基因因环境因素影响而未表达。因此，基因测序不足以揭示ARG的行为和风险，在单细胞水平上建立表型功能和基因型之间的联系具有重要意义。
图4. 分选耐药菌种的耐药基因亚型丰度。β-内酰胺基因存在于Cephr株中，而不存在于Cephs中。
Q4
结论
在这项研究中，我们应用了Raman-DIP、单细胞分选和基因组测序技术，在单细胞水平上建立了人类肠道菌群中ARB表型与基因型的联系。研究结果表明，在两个健康个体的肠道菌群中存在大量ARB，在不同浓度的阿莫西林，头孢氨苄，四环素，氟苯尼考和万古霉素作用下，耐药菌的丰度之间存在显着差异，这很可能与个人对抗生素的接触史有关。随后，应用单细胞分选仪PRECI SCS从菌群中分离出ARB单细胞，并进行16S rRNA测序及全基因组测序。我们在物种水平上鉴定了两个健康个体中的ARB以及这些ARB的抗性基因。通过鉴定万古霉素抗性基因的基因型和不表达的拉曼表型，我们证明了基因组方法（例如宏基因组测序）的可能偏差。
我们证明了Raman-DIP、单细胞分选和测序相结合是一种检测复杂样品（如人类肠道菌群）中功能微生物的创新技术，这一新颖的技术有望用于进一步的研究中，例如粪便移植的人类肠道菌群的质量控制、人类肠道中的细菌-细菌相互作用以及肠道菌群对人类疾病的影响等研究，此技术具有促进个体化健康领域研究的潜力。
图5. 单细胞分选仪HOOKEPRECISCS
辰英科仪自主研制的单细胞分选仪PRECI SCS具有独特的可视化分选功能，所见即所得，精准实现目标细胞的逐一分离。采用独特的激光与物质相互作用原理，对于复杂生物样本中形态各异的细胞，可实现非标记状态下的精准分离。对于百纳米级的单个微生物细胞也同样适用。
PRECI SCS具有可视化、精准、广泛适用等特点，除能够与本文中的拉曼识别技术相结合外，还可与形态、荧光等多种细胞识别技术联合使用，应对不同应用场景。搭载潜心研制的HOOKE IntP智能软件，实现单细胞图像智能识别、一键自动分选、全自动细胞获取等。设备操作流程简易，为单细胞测序、未培养微生物开发、工程细胞筛选、细胞图谱绘制等研究提供完美解决方案，助力前沿科学研究。
