在本研究中，提出了一种利用多点扫描共聚焦拉曼光谱技术。通过图像识别算法和高精度位移台的控制，拉曼光谱可以一次曝光时采集微生物内多点生化成分信息，以便充分表征微生物单细胞内的成分信息。这就解决了被测微生物单细胞大小不一而共聚焦拉曼系统的激光光斑不易改变的问题。然后分别测量三种大肠杆菌和七种乳酸菌的单细胞拉曼光谱，采用常用的监督分类方法对单点光谱和多点扫描光谱的数据进行比较，多点扫描光谱在准确率和召回率方面都表现出更好的性能。
图1. 微生物单细胞多点扫描拉曼光谱采集及分析流程图
（1）首先为了从拉曼光谱的角度验证微生物的空间异质性，采集了三种微生物（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌）单细胞的mapping数据。图2表明不同空间位置的微生物拉曼光谱由于其空间异质性而有细微差异。由于不同的微生物表型具有独特的分子组成，但这些差异在拉曼光谱中是微小的，并且亲属之间越接近，差异越小。因此，由于微生物的空间异质性，拉曼光谱的细微差异会影响微生物识别的准确性。
图2. 三种微生物的mapping图像及四个位置的拉曼光谱
（2）由于选择测试的细菌长度为2~5μm，激光光斑尺寸约为1μm，为了使光斑覆盖整个细菌，多点扫描拉曼光谱选择测试点数为5。使用600g/mm光栅分别采集了七种微生物的单点光谱和五点扫描光谱数据，两类数据采集条件均相同，采用支持向量机（SVM）对两类数据进行比较。结果表明，五点扫描光谱数据中各种细菌的召回率均高于单点光谱数据，五点扫描光谱数据的召回率均大于90%。单点光谱数据和五点扫描光谱数据的整体识别准确率分别为94.1±2.6%和97.6±1.7%，五点扫描光谱数据识别准确率提高了约3.7%。因此，五点扫描光谱数据模型的分类性能优于单点光谱数据模型。使用1200g/mm光栅分别采集了四种微生物的单点光谱和五点扫描光谱数据，也同样得到了此结果。
图3. 使用600 g/mm光栅采集的6种微生物的单点光谱数据（a）和五点扫描光谱数据（b）的SVM混淆矩阵
图4. 使用1200 g/mm光栅采集的4种微生物的单点光谱数据（a）和五点扫描光谱数据（b）的SVM混淆矩阵
