《Talanta》|中国科学院长春光机所李备研究员X-Lab团队成功开发新型单细胞液体拉曼光谱检测芯片

2024年11月1日，中国科学院长春光机所李备研究员X-lab团队与格拉斯哥大学徐嘉宝博士在《Talanta》上合作发表题为“Microwell-Assembled Aluminum Substrates for Enhanced Single-Cell Analysis: A Novel Approach for Cancer Cell Profiling by Raman Spectroscopy”的文章，第一作者为X-Lab王云桐博士。文中开发了一种新型拉曼光谱检测芯片，可用于液体环境中单细胞的拉曼光谱检测，成功实现了肺癌细胞与正常细胞的拉曼分类模型构建。长光辰英核心产品——P300共聚焦拉曼光谱仪为本文中单细胞拉曼检测提供了高稳定性、高精度的检测平台。

近年来，随着对细胞群体内在异质性认识的深入，单细胞水平的研究受到广泛关注。传统技术如流式细胞术、单细胞测序和质谱分析等，在推进单细胞分析研究中发挥了重要作用，但也存在空间分辨率低、破坏细胞完整性和生物信息提取速度慢等局限。自发拉曼光谱作为一种无创、无标记、快速准确的检测手段，在生物领域的应用日益增多，能够精确“快照”单细胞的化学成分和代谢状态。然而，由于细胞贴壁培养和干燥收缩的特性，目前的单细胞拉曼光谱检测难以在液体环境中对非固定细胞进行精准测量。本文介绍了一种新型微孔组装金属基板芯片，实现了无标记、无创、精准的活性单细胞拉曼检测，并利用该芯片和拉曼光谱平台实现了癌细胞与正常细胞间的区分。

本文设计了一款新型微孔组装金属基板芯片。该芯片利用金属基板增强了液体中的自发拉曼信号强度，提高了信噪比 （SNR）；利用微孔防止了细胞堆积，确保准确捕获拉曼信号。十余万个微孔阵列有助于实现高通量细胞检测，并为液体中悬浮细胞的拉曼测量提供稳定条件。依次进行细胞培养、重悬、清洗，点样至芯片上，对PC-9肺癌细胞和BEAS-2B正常支气管上皮细胞进行拉曼光谱的采集，以验证芯片的适用性。此外，本研究还运用机器学习分类模型对两种细胞进行分类，以评估新型芯片结合拉曼检测的精度和稳定性。

本文中的微孔芯片经过精确设计，可匹配靶细胞大小，确保每个微孔只容纳一个细胞（图1），通过等离子体处理组装了金属涂层的基材和微孔。该设计有助于更有效地捕获单细胞，并能够准确、稳定地采集单细胞拉曼光谱，这对于详细的单细胞分析至关重要。

将普通金属基板与新型微孔金属基板进行比较，滴加同样的液滴后，普通金属基板的液滴扩散不均匀，且细胞垂直堆积严重（图2a, b）。在普通基板上检测拉曼的过程中，受到液体表面张力的影响，导致细胞在1s内离开激光检测位置（图2c, d），严重影响单细胞拉曼检测采集的稳定性。

相比之下，新型微孔金属基板在滴加液滴后，由于微孔聚对二甲苯材料的疏水性以及微孔的高纵横比，有效降低了表面张力并破坏了流体界面处的横向剪切力，最大限度地降低了细胞垂直堆积。另外，微孔的存在使得细胞在液体环境中被高效捕获并固定（图2e），极大减少了细胞的运动，为单细胞拉曼信号的采集提供了更高的稳定性和准确性。

将PC-9细胞分别加样在金属基底微孔板和玻璃底微孔板上，在5mW，3s的拉曼检测条件下，对该细胞指纹区的平均光谱和光谱信噪比进行了统计。结果发现，金属基底微孔板较普通玻璃底微孔板的光谱信号强度更强（图3a, b），光谱间的标准差更小（图3c），平均信噪比显著提高了70.34％（图3d）。上述结果表明，金属基底微孔板上的细胞能够产生更高的信噪比和更稳定的拉曼信号，而新型微孔组装金属基板芯片上结合了十几万微孔小室与金属基底稳定增强拉曼信号，预计能够实现高通量单细胞拉曼检测。

图3微孔金属基板与微孔玻璃基板对拉曼信号采集的影响

图a为金属基板上单细胞平均拉曼光谱；图b为玻璃基板上单细胞平均拉曼光谱（灰色部分为拉曼光谱标准差）；图c为两种基板上拉曼光谱信噪比统计；图d为两种基板上单细胞拉曼光谱信噪比丰度统计

采用新型微孔组装金属基板芯片采集肺癌细胞PC-9和正常支气管上皮细胞BEAS-2B的拉曼光谱（图4a），衔接t-SNE算法对光谱数据进行降维可视化，结果显示两种细胞的拉曼光谱呈现两个不同的单细胞簇，分别代表两种细胞类型（图4b）。

图4 肿瘤细胞与正常细胞拉曼光谱采集与无监督聚类

图a为基于新型芯片与共聚焦拉曼光谱仪平台对两种细胞采集的平均拉曼光谱；图b为两种细胞拉曼光谱t-SNE无监督聚类的可视化结果

为了进一步提升所述分类平台的性能，本研究采用了监督式机器学习算法，包括k近邻（kNN）和极端梯度提升（XGBoost），以构建高效的分类模型。通过将两种细胞的拉曼光谱数据按照4:1的比例划分为训练集和测试集，并运用三重交叉验证方法来评估模型的可靠性，确保了模型评估的严谨性和准确性。实验结果表明，kNN模型的分类准确度达到了97.8%（图5ab），而XGBoost模型的分类准确度更是达到了完美的100%（图5cd）。这两种分类模型的高识别精度一致性地证实了微孔组装金属基板芯片在提升单细胞拉曼信号质量和识别率方面的显著效果。结合这些先进的监督式机器学习算法，该平台在临床诊断和精准医疗领域展现出巨大的应用潜力，有望实现对单细胞层面的精确分析和诊断。

图5 监督式机器学习算法对肿瘤细胞和正常细胞的分类

图ab分别为kNN算法测试集的混淆矩阵与可靠性验证的ROC曲线；图cd分别为XGBoost算法测试集的混淆矩阵与可靠性验证的ROC曲线

本文介绍了一种创新的微孔组装金属基板芯片，该芯片在单细胞领域展现出显著效果，有效避免了细胞在液体环境中的堆叠现象，并成功实现了液体环境下的单细胞拉曼光谱检测。通过对比癌细胞PC-9与正常细胞BEAS-2B的单细胞拉曼光谱，验证了该芯片与拉曼光谱仪结合平台在细胞成分分析和肿瘤细胞分类上的应用潜力与可靠性。这一成果为生物医学领域，尤其是在癌症研究和药物开发等关键领域，提供了一种新的、可靠的单细胞拉曼分析手段。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0039914024015285?via%3Dihub